嚴重急性呼吸系統綜合征冠狀病毒2型（Severe Acute Respiratory Syndrome Coronavirus 2，SARS-CoV-2）造成了新型冠狀病毒肺炎（Corona Virus Disease 2019，COVID-19）的大流行。盡管COVID-19疫苗的研發取得了巨大的成功，但由于毒株的頻繁變異和全球較低的疫苗接種率，SARS-CoV- 2大流行對人類健康帶來了持久的挑戰，因此迫切需要研發針對SARS-CoV-2變異毒株的新型廣譜治療方法。
美國西北大學醫學院和美國德州大學MD安德森癌癥中心在Nature Communications雜志上發表了一項新發現，該研究發現新冠肺炎患者的血液中存在含有血管緊張素轉化酶2蛋白的天然納米級大小的囊泡-evACE2，它具有先天廣譜抗病毒機制，可阻止不同變異類型新冠病毒毒株的感染，包括已經出現的多種新冠病毒變異株和未來可能出現的冠狀病毒。
研究成果（圖源：Nature Communications）
SARS-CoV-2的野生株（WT）和突變株通過進入受體血管緊張素轉換酶2（Angiotensin Converting Enzyme 2，ACE2）感染宿主細胞，如人肺細胞。細胞外囊泡（Extracellular vesicles，EV）是血液等液體的重要組成部分之一，包括外泌體和微囊泡。外泌體是具特征的小型EV之一，可能參與多種生理和病理生物學功能，或可作為新的生物標記物和下一代生物療法。從植物和人類樣本中提取的外泌體已應用于臨床試驗，用于治療炎癥性疾病和癌癥。根據EV領域廣泛采用的命名法以及分離異源囊泡群的可能性，研究人員將其中富集的外泌體統稱為“EVs”。
研究人員對人類血漿樣品中的EVs進行MFV分析，發現COVID-19患者的血漿中ACE2+EVs升高，與血清陰性對照組相比，急性期有較大幅度的增加，恢復期有適度的增加。SARS-CoV-2感染觸發了過量表達ACE2的人肺細胞A549細胞分泌ACE2+TSG101+EVs，這意味著ACE2+EVs上調是COVID-19患者對SARS-CoV-2感染的先天反應。
研究人員應用人類細胞系HEK-293（HEK）和HeLa，用于表征EVs中ACE2表達，并測定evACE2對SARS-CoV-2的結合活性和中和功能。實驗表明，evACE2富集在小的EVs中，在假定的外泌體中檢測到的可能性很小。進一步研究表明，SARS-CoV-2進入受體ACE2蛋白，在EVs上表達。
COVID-19患者的外周血中EVs增加（圖源：Nature Communications）
研究人員通過評估SARS-CoV-2 蛋白與人類宿主細胞的結合來分析evACE2對病毒附著和感染的影響。正如預期的那樣，ACE2HEK細胞與紅色熒光團AF-647結合的RBD蛋白表現出特異且穩定的結合。相比之下，等量的ACE2EV的效果可以忽略不計，這表明ACE2EV通過誘導ACE2抑制其細胞受體ACE2對EV的SARS-CoV-2 RBD識別。作為陽性對照，rhACE2也抑制RBD與人類ACE2細胞的結合。對比分析發現，evACE2比rhACE2更有效地阻斷SARS-CoV-2 RBD與人類宿主細胞的結合。
接下來，研究人員又評估了evACE2和rhACE2對SARS-CoV-2及其變種的中和作用。結果表明，與rhACE2相比，ev1ACE2（HEK）和ev2ACE2（HeLa）在阻斷假病毒感染方面的中和效率估計分別高出58倍和34倍。鑒于實驗設置限制，還需進一步實驗。實驗數據表明，evACE2在阻斷SARS-CoV-2病毒感染方面至少達到了估計的80倍的中和效果，PCR測試也驗證了這一結果。
為了研究evACE2中和SARSCoV-2變體的潛力，團隊采用假型和真實SARS-CoV-2感染試驗。與WT相比，evACE2在阻斷假型SARS-CoV-2變體的感染方面取得了高達4至5倍的功效，這些變體表達了B1.1.7（α變體）、B1.351（β變體）和B.1.617.2（δ變體）的S蛋白突變體。在evACE2介導的對SARS-CoV-2變體的中和作用中也得到了類似的結果，其中evACE2對α和β變體的感染的抑制效果與WT相似或更大。總而言之，研究結果支持evACE2作為一種創新方法來預防或限制SARS-CoV-2病毒感染，包括WT和變異株。
evACE2對RBD結合和SARS-CoV-2變異感染的中和作用（圖源：Nature Communications）
先前研究發現evACE2可能存在先天抗病毒機制，研究人員對此進行了細致研究。血漿中和活性對ACE2+EVs和RBD-IgG水平的多變量線性回歸顯示比單獨的RBD-IgG水平提高（模型的擬合度），這一結果支持ACE2+EVs具有潛在抗病毒貢獻。為了確定血漿EVs對中和功能的貢獻，研究人員從血清陰性對照組和COVID-19患者的血漿樣品中分離出EVs，質譜分析證實了ACE2和EV蛋白的存在。
值得注意的是，從6名急性期COVID-19患者中的5名血漿中分離出的EV顆粒，尤其是CBB-007和CBB-012（未檢測到RBD-IgG）完全阻斷了SARS-CoV-2感染引起的細胞死亡。血清陰性對照組和沒有檢測到ACE2 EVs的CBB-005未顯示任何病毒中和作用，這表明血漿中的ACE2+ EVs水平可能受SARS-CoV2感染調控。因此，研究人員又耗盡血漿顆粒中的大部分ACE2+EVs，其從五個血漿樣本（康復期的CSB-012和CSB-24，以及急性期的CBB-008、009和013）中分離出的ACE2+EVs的耗竭，明顯削弱了血漿EVs中和RBD與ACE2+HEK細胞結合的能力，這表明COVID-19患者血漿中的ACE2+EVs至少是抗SARS-CoV-2活性的部分原因。
患者血漿中的evACE2能中和SARS-CoV-2（圖源：Nature Communications）
治療性evACE2的患者血漿分析和小鼠生物分布情況（圖源：Nature Communications）
為了驗證發現的evACE2是否能作為治療COVID-19的誘餌療法，研究人員使用已建立的hACE2轉基因COVID-19小鼠模型評估了其臨床前療效。雙盲病理評分顯示，evACE2治療在很大程度上減少了SARS-CoV-2感染小鼠的肺部炎癥。與對照組EV治療的小鼠相比，肺泡出血和壞死評分明顯降低。進一步驗證鼻腔遞送的ACE2+EVs的研究表明，evACE2在治療COVID-19發病機制方面取得了良好的臨床前療效。
（圖源：Nature Communications）研究團隊已經確定evACE2是一種創新的誘餌療法，可以有效地阻斷SARS-CoV-2及其變體引起的傳染病，并可能阻斷所有未來出現的利用ACE2作為其初始連接受體的冠狀病毒。目前，團隊正在申請有關evACE2的專利，開發evACE2作為預防和治療新冠肺炎的生物治療產品。
參考資料：
嚴重急性呼吸系統綜合征冠狀病毒2型（Severe Acute Respiratory Syndrome Coronavirus 2，SARS-CoV-2）造成了新型冠狀病毒肺炎（Corona Virus Disease 2019，COVID-19）的大流行。盡管COVID-19疫苗的研發取得了巨大的成功，但由于毒株的頻繁變異和全球較低的疫苗接種率，SARS-CoV- 2大流行對人類健康帶來了持久的挑戰，因此迫切需要研發針對SARS-CoV-2變異毒株的新型廣譜治療方法。
美國西北大學醫學院和美國德州大學MD安德森癌癥中心在Nature Communications雜志上發表了一項新發現，該研究發現新冠肺炎患者的血液中存在含有血管緊張素轉化酶2蛋白的天然納米級大小的囊泡-evACE2，它具有先天廣譜抗病毒機制，可阻止不同變異類型新冠病毒毒株的感染，包括已經出現的多種新冠病毒變異株和未來可能出現的冠狀病毒。
研究成果（圖源：Nature Communications）
SARS-CoV-2的野生株（WT）和突變株通過進入受體血管緊張素轉換酶2（Angiotensin Converting Enzyme 2，ACE2）感染宿主細胞，如人肺細胞。細胞外囊泡（Extracellular vesicles，EV）是血液等液體的重要組成部分之一，包括外泌體和微囊泡。外泌體是具特征的小型EV之一，可能參與多種生理和病理生物學功能，或可作為新的生物標記物和下一代生物療法。從植物和人類樣本中提取的外泌體已應用于臨床試驗，用于治療炎癥性疾病和癌癥。根據EV領域廣泛采用的命名法以及分離異源囊泡群的可能性，研究人員將其中富集的外泌體統稱為“EVs”。
研究人員對人類血漿樣品中的EVs進行MFV分析，發現COVID-19患者的血漿中ACE2+EVs升高，與血清陰性對照組相比，急性期有較大幅度的增加，恢復期有適度的增加。SARS-CoV-2感染觸發了過量表達ACE2的人肺細胞A549細胞分泌ACE2+TSG101+EVs，這意味著ACE2+EVs上調是COVID-19患者對SARS-CoV-2感染的先天反應。
研究人員應用人類細胞系HEK-293（HEK）和HeLa，用于表征EVs中ACE2表達，并測定evACE2對SARS-CoV-2的結合活性和中和功能。實驗表明，evACE2富集在小的EVs中，在假定的外泌體中檢測到的可能性很小。進一步研究表明，SARS-CoV-2進入受體ACE2蛋白，在EVs上表達。
COVID-19患者的外周血中EVs增加（圖源：Nature Communications）
研究人員通過評估SARS-CoV-2 蛋白與人類宿主細胞的結合來分析evACE2對病毒附著和感染的影響。正如預期的那樣，ACE2HEK細胞與紅色熒光團AF-647結合的RBD蛋白表現出特異且穩定的結合。相比之下，等量的ACE2EV的效果可以忽略不計，這表明ACE2EV通過誘導ACE2抑制其細胞受體ACE2對EV的SARS-CoV-2 RBD識別。作為陽性對照，rhACE2也抑制RBD與人類ACE2細胞的結合。對比分析發現，evACE2比rhACE2更有效地阻斷SARS-CoV-2 RBD與人類宿主細胞的結合。
接下來，研究人員又評估了evACE2和rhACE2對SARS-CoV-2及其變種的中和作用。結果表明，與rhACE2相比，ev1ACE2（HEK）和ev2ACE2（HeLa）在阻斷假病毒感染方面的中和效率估計分別高出58倍和34倍。鑒于實驗設置限制，還需進一步實驗。實驗數據表明，evACE2在阻斷SARS-CoV-2病毒感染方面至少達到了估計的80倍的中和效果，PCR測試也驗證了這一結果。
為了研究evACE2中和SARSCoV-2變體的潛力，團隊采用假型和真實SARS-CoV-2感染試驗。與WT相比，evACE2在阻斷假型SARS-CoV-2變體的感染方面取得了高達4至5倍的功效，這些變體表達了B1.1.7（α變體）、B1.351（β變體）和B.1.617.2（δ變體）的S蛋白突變體。在evACE2介導的對SARS-CoV-2變體的中和作用中也得到了類似的結果，其中evACE2對α和β變體的感染的抑制效果與WT相似或更大。總而言之，研究結果支持evACE2作為一種創新方法來預防或限制SARS-CoV-2病毒感染，包括WT和變異株。
evACE2對RBD結合和SARS-CoV-2變異感染的中和作用（圖源：Nature Communications）
先前研究發現evACE2可能存在先天抗病毒機制，研究人員對此進行了細致研究。血漿中和活性對ACE2+EVs和RBD-IgG水平的多變量線性回歸顯示比單獨的RBD-IgG水平提高（模型的擬合度），這一結果支持ACE2+EVs具有潛在抗病毒貢獻。為了確定血漿EVs對中和功能的貢獻，研究人員從血清陰性對照組和COVID-19患者的血漿樣品中分離出EVs，質譜分析證實了ACE2和EV蛋白的存在。
值得注意的是，從6名急性期COVID-19患者中的5名血漿中分離出的EV顆粒，尤其是CBB-007和CBB-012（未檢測到RBD-IgG）完全阻斷了SARS-CoV-2感染引起的細胞死亡。血清陰性對照組和沒有檢測到ACE2 EVs的CBB-005未顯示任何病毒中和作用，這表明血漿中的ACE2+ EVs水平可能受SARS-CoV2感染調控。因此，研究人員又耗盡血漿顆粒中的大部分ACE2+EVs，其從五個血漿樣本（康復期的CSB-012和CSB-24，以及急性期的CBB-008、009和013）中分離出的ACE2+EVs的耗竭，明顯削弱了血漿EVs中和RBD與ACE2+HEK細胞結合的能力，這表明COVID-19患者血漿中的ACE2+EVs至少是抗SARS-CoV-2活性的部分原因。
患者血漿中的evACE2能中和SARS-CoV-2（圖源：Nature Communications）
治療性evACE2的患者血漿分析和小鼠生物分布情況（圖源：Nature Communications）
為了驗證發現的evACE2是否能作為治療COVID-19的誘餌療法，研究人員使用已建立的hACE2轉基因COVID-19小鼠模型評估了其臨床前療效。雙盲病理評分顯示，evACE2治療在很大程度上減少了SARS-CoV-2感染小鼠的肺部炎癥。與對照組EV治療的小鼠相比，肺泡出血和壞死評分明顯降低。進一步驗證鼻腔遞送的ACE2+EVs的研究表明，evACE2在治療COVID-19發病機制方面取得了良好的臨床前療效。
（圖源：Nature Communications）研究團隊已經確定evACE2是一種創新的誘餌療法，可以有效地阻斷SARS-CoV-2及其變體引起的傳染病，并可能阻斷所有未來出現的利用ACE2作為其初始連接受體的冠狀病毒。目前，團隊正在申請有關evACE2的專利，開發evACE2作為預防和治療新冠肺炎的生物治療產品。
參考資料：
