摘要：麻省總醫(yī)院領(lǐng)導(dǎo)的研究團(tuán)隊(duì)近日報(bào)告稱，一種新的CRISPR-Cas9變體不需要PAM序列，就能在體外對任何DNA堿基進(jìn)行切割。
麻省總醫(yī)院領(lǐng)導(dǎo)的研究團(tuán)隊(duì)近日報(bào)告稱，一種新的CRISPR-Cas9變體不需要PAM序列，就能在體外對任何DNA堿基進(jìn)行切割。這種可在幾乎任意位點(diǎn)實(shí)現(xiàn)精確切割的能力有望應(yīng)用在多個(gè)DNA工程領(lǐng)域。
圖1 新的CRISPR-Cas9變體能在體外對任何DNA堿基進(jìn)行切割（圖源：[1]）
通常來說，野生型CRISPR-Cas9或Cas12酶需要先識別PAM序列，才能與靶位點(diǎn)結(jié)合。同樣，限制性內(nèi)切酶也只能在特定的DNA位點(diǎn)上進(jìn)行切割。
麻省總醫(yī)院的助理研究員Benjamin Kleinstiver表示：“對于體外應(yīng)用而言，這意味著研究人員沒有足夠的靈活性來切割任意位點(diǎn)上的DNA，因?yàn)槲覀兪褂玫墓ぞ哒艿竭@些短的序列motif的限制。”
于是，麻省總醫(yī)院的研究人員在2020年設(shè)計(jì)出一種近乎不受PAM限制的變體，并將其命名為SpRY。近日，Kleinstiver及其同事在《Nature Biotechnology》雜志上報(bào)告稱，SpRY DNA消化（SpRYgest）過程可在體外切割幾乎任何DNA序列。他們進(jìn)一步優(yōu)化了消化過程（包括向?qū)NA合成），以便其能夠更廣泛地應(yīng)用。
在分析過程中，研究人員首先比較了野生型SpCas9和變體SpRY在20個(gè)不同位點(diǎn)上產(chǎn)生雙鏈斷裂的能力。在20個(gè)向?qū)NA（gRNA）的幫助下，SpCas9可消化其中的4個(gè)位點(diǎn)，而SpRY可消化其中的19個(gè)位點(diǎn)。
之后，他們比較了野生型SpCas9以及變體SpRY和SpG在64個(gè)位點(diǎn)上的活性，SpG也是一種變體，可識別特定的PAM序列。他們的結(jié)果突出了SpCas9對NGG PAM的偏好以及SpG對NGN PAM的偏好。相反，SpRY可近乎完全消化64個(gè)位點(diǎn)中的59個(gè)，表明它確實(shí)幾乎不受PAM序列的限制。
SpRYgest可以用在一系列應(yīng)用中。例如，它可與等溫組裝方法一起用在分子克隆中，比如質(zhì)粒交換。此外，正如研究人員在論文中所指出的，SpRYgest可用來生成飽和突變文庫，去除NGS文庫中不想要的序列，以及測序方案中的靶向富集。
圖2 DNA靶向核酸內(nèi)切酶的比較（圖源：[1]）
為了讓SpRYgest得到更廣泛的應(yīng)用，研究人員還對gRNA合成方案進(jìn)行了改進(jìn)。他們將模板生成與體外轉(zhuǎn)錄（IVT）步驟相結(jié)合，將IVT反應(yīng)時(shí)間縮短至4小時(shí)以內(nèi)。研究人員指出，這種one-pot的gRNA合成方法縮短了手動操作時(shí)間，降低了實(shí)驗(yàn)成本，讓SpRYgest流程更類似于其他分子克隆方法。
Kleinstiver指出，這些優(yōu)化方案讓SpRYgest更容易實(shí)施。“寡核苷酸可以從供應(yīng)商處購買，gRNA轉(zhuǎn)錄試劑盒也可以買到，我們希望以后還可以買到SpRY酶，”他說。他們希望用戶能夠?qū)pRYgest方法融入現(xiàn)有的分子克隆流程中。
參考資料：
[1] Christie, K.A., Guo, J.A., Silverstein, R.A. et al. Precise DNA cleavage using CRISPR-SpRYgests. Nat Biotechnol (2022). https://doi.org/10.1038/s41587-022-01492-y
摘要：麻省總醫(yī)院領(lǐng)導(dǎo)的研究團(tuán)隊(duì)近日報(bào)告稱，一種新的CRISPR-Cas9變體不需要PAM序列，就能在體外對任何DNA堿基進(jìn)行切割。
麻省總醫(yī)院領(lǐng)導(dǎo)的研究團(tuán)隊(duì)近日報(bào)告稱，一種新的CRISPR-Cas9變體不需要PAM序列，就能在體外對任何DNA堿基進(jìn)行切割。這種可在幾乎任意位點(diǎn)實(shí)現(xiàn)精確切割的能力有望應(yīng)用在多個(gè)DNA工程領(lǐng)域。
圖1 新的CRISPR-Cas9變體能在體外對任何DNA堿基進(jìn)行切割（圖源：[1]）
通常來說，野生型CRISPR-Cas9或Cas12酶需要先識別PAM序列，才能與靶位點(diǎn)結(jié)合。同樣，限制性內(nèi)切酶也只能在特定的DNA位點(diǎn)上進(jìn)行切割。
麻省總醫(yī)院的助理研究員Benjamin Kleinstiver表示：“對于體外應(yīng)用而言，這意味著研究人員沒有足夠的靈活性來切割任意位點(diǎn)上的DNA，因?yàn)槲覀兪褂玫墓ぞ哒艿竭@些短的序列motif的限制。”
于是，麻省總醫(yī)院的研究人員在2020年設(shè)計(jì)出一種近乎不受PAM限制的變體，并將其命名為SpRY。近日，Kleinstiver及其同事在《Nature Biotechnology》雜志上報(bào)告稱，SpRY DNA消化（SpRYgest）過程可在體外切割幾乎任何DNA序列。他們進(jìn)一步優(yōu)化了消化過程（包括向?qū)NA合成），以便其能夠更廣泛地應(yīng)用。
在分析過程中，研究人員首先比較了野生型SpCas9和變體SpRY在20個(gè)不同位點(diǎn)上產(chǎn)生雙鏈斷裂的能力。在20個(gè)向?qū)NA（gRNA）的幫助下，SpCas9可消化其中的4個(gè)位點(diǎn)，而SpRY可消化其中的19個(gè)位點(diǎn)。
之后，他們比較了野生型SpCas9以及變體SpRY和SpG在64個(gè)位點(diǎn)上的活性，SpG也是一種變體，可識別特定的PAM序列。他們的結(jié)果突出了SpCas9對NGG PAM的偏好以及SpG對NGN PAM的偏好。相反，SpRY可近乎完全消化64個(gè)位點(diǎn)中的59個(gè)，表明它確實(shí)幾乎不受PAM序列的限制。
SpRYgest可以用在一系列應(yīng)用中。例如，它可與等溫組裝方法一起用在分子克隆中，比如質(zhì)粒交換。此外，正如研究人員在論文中所指出的，SpRYgest可用來生成飽和突變文庫，去除NGS文庫中不想要的序列，以及測序方案中的靶向富集。
圖2 DNA靶向核酸內(nèi)切酶的比較（圖源：[1]）
為了讓SpRYgest得到更廣泛的應(yīng)用，研究人員還對gRNA合成方案進(jìn)行了改進(jìn)。他們將模板生成與體外轉(zhuǎn)錄（IVT）步驟相結(jié)合，將IVT反應(yīng)時(shí)間縮短至4小時(shí)以內(nèi)。研究人員指出，這種one-pot的gRNA合成方法縮短了手動操作時(shí)間，降低了實(shí)驗(yàn)成本，讓SpRYgest流程更類似于其他分子克隆方法。
Kleinstiver指出，這些優(yōu)化方案讓SpRYgest更容易實(shí)施。“寡核苷酸可以從供應(yīng)商處購買，gRNA轉(zhuǎn)錄試劑盒也可以買到，我們希望以后還可以買到SpRY酶，”他說。他們希望用戶能夠?qū)pRYgest方法融入現(xiàn)有的分子克隆流程中。
參考資料：
[1] Christie, K.A., Guo, J.A., Silverstein, R.A. et al. Precise DNA cleavage using CRISPR-SpRYgests. Nat Biotechnol (2022). https://doi.org/10.1038/s41587-022-01492-y
