腺病毒(Adenovirus)是無囊膜的線性雙鏈DNA病毒，在自然界分布廣泛。在腺病毒的試驗中，腺病毒滴度對于保持樣品之間的一致性和實現正確的表達水平是很重要的，因此我們經常需要測量腺病毒滴度。傳統的終點稀釋試驗需要兩周，周期較長，本試劑盒可在48h內快速進行腺病毒滴度的測定，檢測結果較為準確。

實驗原理

腺病毒可以感染并在AD-293/HEK-293細胞中復制，由于腺病毒感染HEK293細胞后可表達六鄰體蛋白（腺病毒基因組編碼的衣殼蛋白）,因此可以通過感染的細胞中的病毒六體蛋白的表達量來檢測病毒的載量。本試劑盒包含抗六鄰體蛋白的特異性抗體，用于識別感染細胞，經過辣根過氧化物酶(HRP)標記的二抗放大信號，并加入辣根過氧化物酶的底物DAB進行染色，使被病毒感染的陽性細胞變成深棕色。通過計算給定區域內深棕色/黑色細胞的數量來確定感染細胞的滴度水平，每個染色細胞對應一個感染單位(single infectious unit,ifu)。

本檢測方法可與1型、2型、5型和6型人腺病毒相兼容，目前已經對基于5型人腺病毒進行了驗證。

產品組成

未提供的必需品

1.磷酸鹽緩沖液(PBS,pH:7.4)

2.磷酸鹽緩沖液+1%牛血清白蛋白(PBS+1%BSA)

3.12/24孔培養板

4.恒溫培養箱(加濕，5%CO?)

5.顯微鏡(×20倍物鏡)

6.細胞計數器

7.細胞培養基(如：DMEM+10%胎牛血清+抗生素)

8.甲醇

使用方法

為了較大限度地提高準確度，每次稀釋的病毒應一式兩份檢測。選取沒有病毒的孔作為陰性對照，滴度實驗所用感染時間應與后續實驗所用感染時間一致。

感染細胞

1在培養板中每孔加入1mL健康的對數期AD-293或HEK 293細胞（12孔板：5×105/mL/孔；24孔板：2.5×105/mL/孔），使用標準培養基，如DMEM+10%FBS+抗生素，確保細胞均勻分布于孔中，以便準確測定滴度，理想情況下，細胞在感染前傳代不應超過6次。

2用PBS或培養基為稀釋液將病毒原液進行10倍系列稀釋，稀釋比例為10-2至10-6；

3在兩個相對應的組織培養孔（步驟1中制備）中分別加入每種病毒稀釋液；

4培養細胞24-48小時（37℃,5%CO?）；

5輕輕地抽吸將培養基從細胞中去除。

6將培養皿置于罩內孵育5-10分鐘，使其干燥。

固定與染色

1、加入預冷的100%甲醇固定細胞

2、在-20℃下孵育10分鐘

3、抽吸液體，用PBS+1%BSA溶液仔細洗滌細胞3次

4、從培養板孔中吸出溶液。然后每孔加入試劑A溶液。37℃孵育1小時，在振蕩器上搖勻

5、重復操作3

6、從培養板孔中吸出液體。然后每孔加入試劑B溶液。37°℃孵育1小時，在振蕩器上搖勻

7、配制1×DAB工作液：取出試劑C,用試劑D 10倍稀釋試劑C(1:9)

8、重復操作3

顯色并計數

1在培養板中每孔加入1×DAB工作液

2室溫孵育15分鐘，或在4°C下孵育過夜，顏色可以增強。

3吸出液體，每孔加入PBS溶液

4使用顯微鏡（×20倍物鏡），隨機選擇至少三個區域進行計數，并且計數的區域應包含5-50個陽性（深棕色/黑色細胞），得出陽性細胞的平均值，若區域內的陽性細胞數較少（5-10個），并假設感染細胞孔中隨機分布，建議您選取更多的區域(例如6-10個計數，以達到相同的準確度。

5計算每孔的感染單位（ifu/mL）=陽性細胞數（區域）×區域數（孔）/病毒樣本體積(mL)x稀釋倍數

注意事項

1.將試劑C底物DAB (10×)保存在-20℃或以下。若要使用該溶液，請取出使用所需的量，并立即將其放回-20℃。請勿將溶液平衡到室溫

2.若所有細胞呈陽性(棕色/黑色)則考慮：

1)沖洗步驟不充分；

2）腺病毒原液稀釋不正確或不充分；

3)試劑B稀釋不正確；

4)DAB工作液配制不正確；

5)沒有用PBS+1%BSA溶液仔細洗滌細胞3次。

3.若細胞單層在固定步驟中被破壞或脫落則考慮：

1)小心移動培養板，以盡量減少對細胞單層的干擾；

2)當加入或吸取溶液時，輕輕地將移液器移到孔的一側，而不是直接移到細胞上，以防止破壞細胞單層；

3)對病毒原液稀釋的不足可能導致細胞脫離培養皿。

本試劑盒僅用于科研和生產過程控制，不能用于人類和動物的醫學診斷。