簡(jiǎn)介

胰蛋白酶(Trypsin),是胰臟分泌的一種絲氨酸肽鏈內(nèi)切酶，可切割賴氨酸及精氨酸C末端形成的肽鍵。作為一種重要消化酶，胰蛋白酶廣泛應(yīng)用于蛋白質(zhì)的酶解/測(cè)序、組織/細(xì)胞的消化、胰島素的生產(chǎn)等各研究領(lǐng)域。在疫苗和病毒載體的研發(fā)和生產(chǎn)過(guò)程中，貼壁細(xì)胞的培養(yǎng)是其中的關(guān)鍵步驟。中國(guó)藥典(2020)在生物制品通則中將胰蛋白酶列為中等風(fēng)險(xiǎn)原料，因此對(duì)于涉及到用胰蛋白酶消化的工藝階段需要進(jìn)行胰蛋白酶的檢測(cè)。

本試劑盒可檢測(cè)天然或重組的豬源胰蛋白酶，并做為胰蛋白酶殘留的評(píng)估，具有較高的檢測(cè)靈敏度與較寬的線性范圍。應(yīng)用于生物制藥工藝開(kāi)發(fā)、生產(chǎn)過(guò)程或產(chǎn)品原液的胰蛋白酶殘留檢測(cè)。

 本試劑盒僅用于科研和生產(chǎn)過(guò)程控制，不能用于人類和動(dòng)物的醫(yī)學(xué)診斷。

實(shí)驗(yàn)原理

本試劑盒應(yīng)用雙抗體夾心酶聯(lián)免疫檢測(cè)技術(shù)測(cè)定樣品中胰蛋白酶的微量殘留。

組分說(shuō)明

使用方法

試劑準(zhǔn)備

1.本試劑對(duì)水份敏感，在開(kāi)瓶前，需將各組分小瓶平衡至室溫，以避免容器內(nèi)的水份冷凝。

2.清洗液的配制：用蒸餾水或純化水10倍(1:9)稀釋試劑E清洗液(10X)，配制實(shí)驗(yàn)用清洗液。長(zhǎng)期使用可放于2℃~8℃保存，效期3個(gè)月。

3.設(shè)置酶標(biāo)儀，讀取波長(zhǎng)450nm/630nm的雙波長(zhǎng)。

4.顯色液的配制：雙組份TMB顯色液由兩部分組成：組分A(含H2O2)和組分B(含TMB),分瓶包裝，臨用前按1:1混合后使用。

5.校準(zhǔn)品的配制：取出試劑盒中的試劑A校準(zhǔn)品(凍干品),加入1mL純水復(fù)溶混勻，混勻后按照下表與圖示，梯度稀釋至5000pg/mL,2000pg/mL,1000pg/mL,500pg/mL,200pg/mL,80pg/mL,32pg/mL,0pg/mL。

6.樣品的配制：

樣品可用所提供的試劑B稀釋液稀釋至檢測(cè)的線性范圍內(nèi)，每個(gè)濃度點(diǎn)應(yīng)起碼配制250μL。計(jì)算結(jié)果時(shí)，需將稀釋后的樣品濃度乘以稀釋倍數(shù)。

未提供的必需品

1.具有450nm和630nm雙波長(zhǎng)檢測(cè)功能的酶標(biāo)儀。 (如果酶標(biāo)儀不能提供雙波長(zhǎng)分析，也可以僅在450nm波長(zhǎng)下讀取)。

2.移液器5-200μLg

3.多通道移液器100μL。

4.蒸餾水或純化水。

5.用于稀釋清洗液的500mL容器。

檢測(cè)操作步驟

1.取所需數(shù)量的組份H預(yù)包被酶標(biāo)板條固定于板架上；向孔中加入校準(zhǔn)品/待測(cè)樣品，每孔100μL,每個(gè)濃度兩個(gè)重復(fù)；

2.輕輕震蕩混勻，貼上封板膜，37℃孵育60分鐘；

3.洗板：甩凈孔中液體，在各反應(yīng)孔中加入稀釋后的實(shí)驗(yàn)用清洗液(由試劑E清洗液稀釋后配制),每孔300μL,停留5秒鐘后甩去孔中液體，重復(fù)3次后一次甩凈拍干。機(jī)洗：每孔中注液量為每孔300μL,洗板3次后一次拍干；

4.加入試劑C Biotin標(biāo)記的檢測(cè)抗體，每孔100μL；

5.輕輕震蕩混勻，貼上封板膜，37℃孵育60分鐘；

6.洗板：甩凈孔中液體，在各反應(yīng)孔中加入稀釋后的實(shí)驗(yàn)用清洗液(由試劑E清洗液稀釋后配制),每孔300μL,停留5秒鐘后甩去孔中液體，重復(fù)3次后一次甩凈拍干。機(jī)洗：每孔中注液量為每孔300μL,洗板3次后一次拍干；

7.加入試劑D鏈霉親和素-辣根過(guò)氧化物酶復(fù)合物，每孔100μL；

8.輕輕震蕩混勻，貼上封板膜，37℃孵育60分鐘；

9.洗板：甩凈孔中液體，在各反應(yīng)孔中加入稀釋后的實(shí)驗(yàn)用清洗液(由試劑E清洗液稀釋后配制)每孔300μL,停留5秒鐘后甩去孔中液體，重復(fù)3次后一次甩凈拍干。機(jī)洗：每孔中注液量為每孔300μL,洗板3次后一次拍干；

10.顯色：加入試劑F顯色液，每孔100μL,20-25℃,避光孵育15分鐘；

11.終止：加入試劑G終止液，每孔100μL,終止反應(yīng)(此時(shí)藍(lán)色立刻轉(zhuǎn)為黃色);

12.測(cè)定：用酶標(biāo)儀在450nm/630nm雙波長(zhǎng)下，讀取各孔的吸光值(O.D.值),如果酶標(biāo)儀不提供雙波長(zhǎng)分析，可以僅在450nm波長(zhǎng)下讀取，測(cè)定應(yīng)在加入終止液后15分鐘以內(nèi)進(jìn)行。

結(jié)果分析與計(jì)算

1.校準(zhǔn)品、待測(cè)樣品均做2個(gè)重復(fù)，取其平均值。

2.用酶標(biāo)儀的自帶軟件(通常是四參數(shù)邏輯曲線擬合)或使用能夠生成四參數(shù)邏輯擬合(log-4PL)的計(jì)算機(jī)軟件制作校準(zhǔn)品劑量-反應(yīng)曲線的回歸方程，再根據(jù)待測(cè)樣品的O.D.值從回歸曲線上返算出樣品中待測(cè)物的濃度。

3.請(qǐng)勿使用線性回歸分析來(lái)推導(dǎo)樣品濃度，避免導(dǎo)致結(jié)果不準(zhǔn)。

4.含有大于5000pg/mL的樣品需用所提供的試劑B稀釋液稀釋后測(cè)定。計(jì)算結(jié)果時(shí)，需將稀釋后的樣品濃度乘以稀釋倍數(shù)。

檢驗(yàn)方法的局限性

1.本品僅適用于Trypsin(豬源胰蛋白酶)殘留檢測(cè)。

2.樣品pH應(yīng)保證在6.0-8.0之間，過(guò)低或過(guò)高的pH可能會(huì)造成測(cè)量值異常。

注意事項(xiàng)

1.本試劑盒適合由合格的技術(shù)人員操作使用。

2.將試劑盒從冷藏環(huán)境中取出并在室溫下平衡20分鐘后方可使用。

3.為了避免試劑、移液槍頭和平板的交叉污染，應(yīng)使用一次性的移液槍頭和試劑容器。未用完的試劑不要重新倒回試劑瓶或試劑管中，注意不要把不同試劑瓶的蓋子弄混而造成交叉污染。

4.加樣：每次加樣的時(shí)間控制在5分鐘以內(nèi)，推薦設(shè)置復(fù)孔，如果樣本數(shù)量多，推薦使用排槍加樣。

5.請(qǐng)于每次測(cè)定時(shí)，同時(shí)做標(biāo)準(zhǔn)曲線（復(fù)孔）。對(duì)于所有測(cè)定步驟，保持從一個(gè)孔到另一個(gè)孔的重復(fù)時(shí)間序列，以確保所有孔的孵育時(shí)間相同。且應(yīng)盡可能快地完成所有步驟，以避免可能導(dǎo)致系統(tǒng)不準(zhǔn)確的“運(yùn)行結(jié)束”順序過(guò)程時(shí)差。

6.孵育：為防止樣品蒸發(fā)，實(shí)驗(yàn)室必須使用封板膜，洗板后應(yīng)盡快進(jìn)行下步操作，避免酶標(biāo)板處于干燥狀態(tài)，嚴(yán)格遵守給定的溫育時(shí)間和溫度。

7.洗板：洗滌過(guò)程中孔中殘留的洗滌液應(yīng)在吸水紙或無(wú)塵干布上拍干，請(qǐng)勿將濾紙直接放入反應(yīng)孔中吸水。

8.顯色：樣品數(shù)量較多，建議使用排槍，請(qǐng)定時(shí)觀察反應(yīng)孔的顏色變化（比如每隔2分鐘），如果梯度已經(jīng)明顯，可提前加終止液終止反應(yīng)，以避免顏色過(guò)深，影響酶標(biāo)儀讀數(shù)；室溫較低時(shí)，也可適當(dāng)延長(zhǎng)顯色時(shí)間，以高校準(zhǔn)品濃度點(diǎn)的OD為2.0-2.5左右較佳。由于實(shí)驗(yàn)人員操作習(xí)慣與實(shí)驗(yàn)環(huán)境影響，本試劑盒的高OD值可能會(huì)有所差異，此為正常現(xiàn)象，顯色液請(qǐng)避光保存。

9.終止：終止試劑是酸性的，操作過(guò)程中需要格外注意，防止與皮膚和眼睛接觸。

10.讀板：上機(jī)讀數(shù)前要用干凈的紙巾輕輕擦拭酶標(biāo)板底部，以清除殘留的液體和手指印，以免影響酶標(biāo)儀讀數(shù)，讀板過(guò)程中OD630nm波長(zhǎng)為校正波長(zhǎng)，若儀器存在差異，也可用650nm代替630nm。